Pääbo-17/8 chap13
Chapitre n°13, Le diable dans les détails, Anne, Razane & Eline
Le chapitre en deux mots
Chapitre 13, LE DIABLE DANS LES DÉTAILS. Le chapitre en deux mots
Mots clés
radioactivité
fractions secondaires
méthylation
enzymes de restriction
Aspects
Raisonnement
Dans ce chapitre, afin de préparer une bibliothèque, l'équipe de Pääbo aimerait trouver un moyen de purifier l'ADN sans trop en perdre. Pääbo pense tout d'abord à un marquage radioactif, mais en marquant l'ADN de phosphore radioactif et lui faisant traverser les différentes étapes de la préparation d'une bibliothèque de séquençage pour 454, il se heurte à des pertes allant jusqu'à 95%, dut en partie à la solution alcaline utilisée pour séparer les deux brins. En poussant la reflexion plus loin, il décide de chauffer l'ADN, ce qui a le même effet que la solution alcaline mais des résultats nettement améliorés, en effet il trouve 10 à 250 fois plus de radioactivité dans leur préparation d'ADN finale.
Un autre problème rencontré par Pääbo et son équipe, était le nombre de cycle de séquençage nécessaire pour obtenir leur bibliothèque de trois milliards de pair de base d'ADN néandertalien.
Technologies de laboratoire
Afin de réduire au maximum les pertes d'ADN néandertalien au cours des étapes de purification de cette molécule, l'équipe va utiliser la radioactivité pour pouvoir quantifier ces pertes. On marque une dose d'ADN néandertalien avec du phosphore radioactif, que l'on place dans une éprouvette. À chaque manipulation, on mesure le degré de radioactivité des fragments restants et on connait la proportion d'ADN perdu. Tout d'abord l'équipe est peu convaincue par cette méthode, mais après avoir fait d'autres tentatives en relation avec la PCR, elle se résout à utiliser la radioactivité. Elle va utiliser plusieurs méthodes pour réduire ses pertes. La première est le chauffage de l'ADN au lieu de l'utilisation de solutions alcalines. La deuxième est de trouver des poches se situant dans les os néandertaliens et contenant plus d'ADN néandertalien pour une plus petite quantité d'ADN bactérien. La proportion d'ADN néandertalien est donc beaucoup plus grande, néanmoins cette deuxième technique n'est pas efficace, car l'on a pas beaucoup plus d'ADN néandertalien. Pour retirer l'ADN bactérien des séquences d'ADN trouvées dans les os, l'équipe décide d'utiliser des anticorps dirigés contre les nucléotides A, très présents dans l'ADN bactérien et inexistants dans l'ADN humain. On élimine ainsi l'ADN bactérien et on obtient une plus grande proportion d'ADN néandertalien. Malgré les variantes, cette technique ne fonctionne pas dans ce cas. La dernière solution est d'identifier des séquences bactériennes spécifiques, afin de les retirer. Grâce aux enzymes de restriction, permettant le découpage de l'ADN de façon plus ou moins précise, on peut retirer les séquences particulières à l'ADN bactérien. (C suivi de G, cette combinaison est rare chez les génomes de mammifères et très présentes chez les génomes bactériens) Cet outil de génie génétique permettrait de dégrader l'ADN bactérien et de laisser plus ou moins intact l'ADN néandertalien. Grâce à cette dernière méthode on passe de 4% d'ADN néandertalien à 20%.
Nature des sciences
L'équipe se rend compte au moyen de la radioactivité qu'elle perd environ 15% d'ADN dans les trois premières étapes et que sur la dernière elle perd plus de 95% d'ADN. L'utilisation de solutions alcalines pour séparer les brins d'ADN est une des causes de cette énorme perte. L'équipe décide donc de chauffer l'ADN pour séparer les deux brins, une technique beaucoup plus efficace et rentable. La difficulté est de trouver la méthode permettant de rendre rentable le pourcentage d'ADN néandertalien dans l'échantillon d'ADN prélevé. L'utilisation d'enzymes de restriction est la solution efficace, car elles découpent des séquences particulières d'ADN bactérien, ce qui fait passer le pourcentage d'ADN néandertalien de 4% à 20%. Les résultats sont tout de suite plus rentables et le reste des expériences repose donc sur une quantité d'ADN néandertalien plus élevée. À la fin du chapitre, il y a une comparaison entre les résultats de l'équipe de Pääbo et de concurrents, et on se rend compte qu'il y a une large différence. Les deux séquences d'ADN néandertalien sont très peu similaires et la méthode de séquençage de Pääbo est mise en cause. On suppose que l'utilisation de la machine 454 pose des problèmes et on estime que plus de 70% de l'ADN pris pour néandertalien était en réalité de l'ADN humain moderne. On déduit que les laboratoires, répétant le travail de Pääbo n'étaient pas équipés comme lui et que ils seraient à l'origine de la contamination humaine.
Questions
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