Pääbo-17/8 chap13
Chapitre n°13, Le diable dans les détails, Anne, Razane & Eline
Le chapitre en deux mots
Chapitre 13, LE DIABLE DANS LES DÉTAILS.
Le chapitre en deux mots
L'équipe de Pääbo remarque qu'elle subit de grandes pertes d'ADN tout au long du processus de purification. Pour quantifier ces pertes, elle utilise la radioactivité et elle se rend compte qu'elle récupère uniquement 4% d'ADN néandertalien. À l'aide de plusieurs méthodes, elle réussit à limiter les pertes.
L'équipe va utilisé la méthylation, c'est-à-dire l'utilisation d'anticorps contre les nucléotides A pour extraire les séquences d'ADN bactérien, néanmoins cette méthode ne fonctionne pas.
La solution finale est d'utiliser les enzymes de restriction, afin de découper l'ADN bactérien, possédant des séquences particulières. Par conséquent, on sépare ces séquences d'ADN bactérien détruites de l'ADN néandertalien.
Mots clés
radioactivité
méthylation
enzymes de restriction
Aspects
Raisonnement
Dans ce chapitre, afin de préparer une bibliothèque, l'équipe de Pääbo aimerait trouver un moyen de purifier l'ADN sans trop en perdre. Pääbo pense tout d'abord à un marquage radioactif, mais en marquant l'ADN de phosphore radioactif et lui faisant traverser les différentes étapes de la préparation d'une bibliothèque de séquençage pour 454, il se heurte à des pertes allant jusqu'à 95%, dut en partie à la solution alcaline utilisée pour séparer les deux brins. En poussant la reflexion plus loin, il décide de chauffer l'ADN, ce qui a le même effet que la solution alcaline mais des résultats nettement améliorés, en effet il trouve 10 à 250 fois plus de radioactivité dans leur préparation d'ADN finale.
Un autre problème rencontré par Pääbo et son équipe, était le nombre de cycle de séquençage nécessaire pour obtenir leur bibliothèque de trois milliards de pair de base d'ADN néandertalien. D'après leur estimation il faudrait 4000 à 6000 cycles ce qui était inconcevable pour le personnel. Pääbo et son équipe savent que dans les os, il y des poches contenant beaucoup moins d'ADN bactériens et une proportion plus grand d'ADN néandertalien. Mais il faut différencier les deux types d'ADN! Pääbo eut une illumination. Pour pouvoir séparer l'ADN néandertalien endogène de l'ADN bactérien ils devaient utiliser la méthylation, procédé qui consiste à utiliser des anticorps contre les A méthylés, qui se lieront à l'ADN bactérien, ce qui permettra de le retirer plus facilement. Mais cela n'a malheureusement pas fonctionné pour eux. Ce qui nous amène à une autre solution, toujours pour le même problème. Grâce à une découverte d'un étudiant du groupe de Pääbo, ils savaient maintenant que certaines combinaisons de nucléotides se rencontraient plus souvent dans l'ADN bactérien que dans celui néandertalien. En utilisant des enzymes de restrictions, le séquenceur a pu donner environ 20% d'ADN néandertalien, ce qui fut un immense progrès comparé au résultat de la manipulation en chauffant, qui était de seulement 4%. Enfin grâce à cette avancée dans leur projet, Pääbo et son équipe pouvaient procéder aux cycles, qui maintenant s'élevait à 700 au lieu de 4000. Il est donc théoriquement possible d'atteindre leur objectif.
Technologies de laboratoire
Afin de réduire au maximum les pertes d'ADN néandertalien au cours des étapes de purification de cette molécule, l'équipe va utiliser la radioactivité pour pouvoir quantifier ces pertes. On marque une dose d'ADN néandertalien avec du phosphore radioactif, que l'on place dans une éprouvette. À chaque manipulation, on mesure le degré de radioactivité des fragments restants et on connait la proportion d'ADN perdu. Tout d'abord l'équipe est peu convaincue par cette méthode, mais après avoir fait d'autres tentatives en relation avec la PCR, elle se résout à utiliser la radioactivité. Elle va utiliser plusieurs méthodes pour réduire ses pertes. La première est le chauffage de l'ADN au lieu de l'utilisation de solutions alcalines. La deuxième est de trouver des poches se situant dans les os néandertaliens et contenant plus d'ADN néandertalien pour une plus petite quantité d'ADN bactérien. La proportion d'ADN néandertalien est donc beaucoup plus grande, néanmoins cette deuxième technique n'est pas efficace, car l'on a pas beaucoup plus d'ADN néandertalien. Pour retirer l'ADN bactérien des séquences d'ADN trouvées dans les os, l'équipe décide d'utiliser des anticorps dirigés contre les nucléotides A, très présents dans l'ADN bactérien et inexistants dans l'ADN humain. On élimine ainsi l'ADN bactérien et on obtient une plus grande proportion d'ADN néandertalien. Malgré les variantes, cette technique ne fonctionne pas dans ce cas. La dernière solution est d'identifier des séquences bactériennes spécifiques, afin de les retirer. Grâce aux enzymes de restriction, permettant le découpage de l'ADN de façon plus ou moins précise, on peut retirer les séquences particulières à l'ADN bactérien. (C suivi de G, cette combinaison est rare chez les génomes de mammifères et très présentes chez les génomes bactériens) Cet outil de génie génétique permettrait de dégrader l'ADN bactérien et de laisser plus ou moins intact l'ADN néandertalien. Grâce à cette dernière méthode on passe de 4% d'ADN néandertalien à 20%.
Nature des sciences
L'équipe se rend compte au moyen de la radioactivité qu'elle perd environ 15% d'ADN dans les trois premières étapes et que sur la dernière elle perd plus de 95% d'ADN. L'utilisation de solutions alcalines pour séparer les brins d'ADN est une des causes de cette énorme perte. L'équipe décide donc de chauffer l'ADN pour séparer les deux brins, une technique beaucoup plus efficace et rentable. La difficulté est de trouver la méthode permettant de rendre rentable le pourcentage d'ADN néandertalien dans l'échantillon d'ADN prélevé. L'utilisation d'enzymes de restriction est la solution efficace, car elles découpent des séquences particulières d'ADN bactérien, ce qui fait passer le pourcentage d'ADN néandertalien de 4% à 20%. Les résultats sont tout de suite plus rentables et le reste des expériences repose donc sur une quantité d'ADN néandertalien plus élevée. À la fin du chapitre, il y a une comparaison entre les résultats de l'équipe de Pääbo et de concurrents, et on se rend compte qu'il y a une large différence. Les deux séquences d'ADN néandertalien sont très peu similaires et la méthode de séquençage de Pääbo est mise en cause. On suppose que l'utilisation de la machine 454 pose des problèmes et on estime que plus de 70% de l'ADN pris pour néandertalien était en réalité de l'ADN humain moderne. On déduit que les laboratoires, répétant le travail de Pääbo n'étaient pas équipés comme lui et que ils seraient à l'origine de la contamination humaine.
Questions
Est-il possible de contaminer l'échantillon d'ADN néandertalien, alors qu'on travaille en salle blanche ?
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