Fermentation 2BIOS02 2010

La méthode scientifique

Le mot "science" vient du latin scientia qui signifie "connaissance". Les sciences de la nature s'intéressent aux connaissances sur la réalité physique du monde dans lequel nous vivons. L'activité scientifique présuppose, d'une part, l'existence d'une réalité accessible et, d'autre part, la capacité de la comprendre, du moins en partie.

S'il n'y a pas de méthode pour construire la science, il en existe une pour la juger, une fois qu'elle a été construite, c'est-à-dire une méthode permettant de déterminer si une représentation scientifique est conforme à la réalité.

Selon Roland Omnès il existe une méthode bien définie qui fait ressortir la spécificité de la science : la méthode à quatre temps.

On peut représenter ces quatre temps de façon cyclique.

• L'exploration consiste à observer des phénomènes avant que l'on ait avancé une hypothèse qu'il va falloir vérifier.
  
• La conceptualisation conduit à l'élaboration de modèles qui pourraient régir la représentation du réel.
  
• L'élaboration échafaude les conséquences logiques qui découlent des hypothèses envisagées.
  
• Le test de l'expérimentation : on doit pouvoir tester les prévisions qu'on peut faire à partir du modèle. Pour être valable une théorie doit pouvoir être réfutée.

Introduction

La fermentation est une réaction biochimique qui consiste à convertir de l'énergie chimique contenue dans une source de carbone (glucose principalement) en une autre forme d'énergie qui sera utilisée par la cellule en l'absence de dioxygène (milieu anaérobie). La production d'énergie chimique (ATP) est cependant très faible. Il faut savoir que la forte libération d'ATP se fait lors de la respiration cellulaire, c'est-à-dire en présence de dioxygène.

Deux des produits principaux de la fermentation sont l'éthanol et le lactate (fermentation alcoolique ou lactique).

Il faut donc retenir que l'objectif principal de la fermentation est de produire de l'énergie(ATP) à partir du glucose synthétisé lors de la photosynthèse. Par ailleurs l'une des conséquences de cette réaction biochimique est la libération de gaz carbonique, ingrédient nécessaire à la photosynthèse qui est en fait le mécanisme opposé à la respiration et à la fermentation. En ce qui concerne le but de l'expérience réalisée en classe, il s'agit de démontrer si la fermentation se fait dans tout les cas que nous avons définis comme « à tester » dans la partie expérimentale. En d'autre mots, nous voulons voir si toutes les combinaisons de bêcher que nous allons exposer soit à 70 degré, soit à 37 degré ou encore à 0 degré se remplissent de C02 grâce aux levures. Nous voulons savoir si le fait de chauffer de façon intermédiaire les levures à une température très élevée (70 degré environ) ou encore de les faire refroidir à 0 degré influe le mécanisme. Nous voulons également savoir si l'absence de composant à la fermentation, soit le glucose ou même la levure que l'on imagine indispensable au processus va nuire à cette fermentation. En bref toute ces questions feront l'objet de notre approche du sujet et de la compréhension de notre expérience. Des ballons de couleurs différentes nous indiquerons quelles solutions à quels paramètres fermentent le plus.

• Annexe Fermentation 1

Les levures

Les levures sont des champignons (mycètes) unicellulaires. Elles peuvent obtenir l'énergie nécessaire à leur survie par respiration ou par fermentation. Au cours de ce laboratoire, nous utiliserons la levure de bière Saccharomyces cerevisiae. Celle-ci est couramment utilisée en industrie alimentaire pour produire des boissons fermentées (vin, bière) ou pour faire lever la pâte (pain). En présence d'oxygène, Saccharomyces cerevisiae fait surtout de la respiration. Par contre, si l'oxygène vient à manquer, elle passe à la fermentation alcoolique. La fermentation ne nécessite pas d'oxygène, mais elle libère environ 15 fois moins d'énergie que la respiration.

La fermentation

La fermentation et la respiration cellulaire aérobie comportent toutes les deux la processus de la glycolyse. Le produit finale de celle-ci, soit le pyruvate, représente un carrefour qui mène à deux voies cataboliques :

• en présence d'oxygène (aérobiose), le pyruvate se fait convertir en acétyl-CoA, et l'oxydation prend la voie du cycle de l'acide citrique (cycle de Krebs).
• en absence d'oxygène (anaérobiose), il se soustrait au cycle de l'acide citrique et prend alors la voie de la fermentation. (cf. annexe 1)

La fermentation alcoolique

Au cours de la fermentation alcoolique, le glucose est converti en gaz carbonique et en éthanol (alcool éthylique). (cf. annexe 2a)

C₆H₁₂O₆ -----> 2CO₂ + 2CH₃-CH₂-OH + ENERGIE

D'autres monosaccharides que le glucose peuvent aussi être utilisés. Certains monosaccharides peuvent directement entrer dans la chaîne de réactions de la fermentation (c'est le cas du fructose). D'autres peuvent être transformés en glucose par des enzymes de la cellule. Dans le cas des disaccharides, ceux-ci doivent d'abord être digérés en monosaccharides. Cette digestion peut se faire à l'extérieur de la cellule ou à l'intérieur de celle-ci. Dans les deux cas, la digestion se fait sous l'action d'enzymes spécifiques synthétisées par la levure.

La fermentation lactique

Lorsque l'apport en oxygène est insuffisant, la plupart des cellules animale régénère le NAD⁺ par un processus de fermentation sans décarboxylation. Les cellules musculaire par exemple utilisent une lactate déshydrogénase, enzyme qui transfère l'hydrogène du NADH sur le pyruvate produit par glycolyse. Cette réaction transforme le pyruvate en lactate et le NADH en NAD⁺, ce qui boucle le cycle métabolique et permet à la glycolyse de se poursuivre tant que du glucose est disponible. Le lactate produit est évacué du muscle par le système sanguin, mais cette élimination n'est pas suffisamment rapide, l'accumulation d'acide lactique interfère avec le fonctionnement du muscle et contribue à la fatigue musculaire.(cf. annexe 2b)

C₆H₁₂O₆ -----> CH₃-CHOH-COOH + ENERGIE

Matériel

Voici le matériel utilisé au cours de nos expériences:

• levure boulangère diluée
• solution de glucose 20%
• béchers, Erlenmeyers, cylindres gradués
• BaOH)₂: hydroxyde de baryum
• pipettes plastiques
• paraffine
• ballons
• bains marie à 37° et 60°C
• agitateur magnétique
• thermomètre
• bac avec des glaçons
• système pour Expérience Eau de Chaux
• pipettes graduées de 2 ml
• gommette
• eau distillée
• microscope
• appareil photo numérique

Méthodes

Expérience 1

Dans cette expérience nous étudierons l'impact de la température sur l'activité métabolique des levures. Le choix des températures doit être pertinent pour provoquer de variations métaboliques observables.
Nous ferons également varier la présence ou l'absence de sucre ou de levures dans certains tubes. Nous veillerons à ne faire varier qu'un facteur à la fois.

Nous disposons de deux bain-maries à 37°C et 70°C et d'un bac rempli de glace.

Les Erlenmeyers sont remplis selon les indications ci-dessous. Ils seront bouchés à l'aide d'un ballon au début de l'expérience (t=0). Il faut bien veiller à vider l'air du ballon au début de l'expérience.

A l'aide du chronomètre, relevez l'état de gonflement des différents ballons toutes les 5 minutes.

Conditions expérimentales

Tube A bleu clair: 50mL levures + 50mL glucose, 37°C

Tube B orange: 50mL levures + 50mL H2O, 37°C; solution sans glucose = contrôle négatif

Tube C jaune: 50mL H2O + 50mL glucose, 37°C; solution sans levure = contrôle négatif

Tube D vert: préincubation à 70°C pendant 15'; 50mL levures + 50mL sucre, 37°C

Tube E rose: préincubation à 0°C pendant 15'; 50mL levures + 50mL sucre, 37°C

Tube F rouge: 50mL levures + 50mL glucose, 0°C

Tube G gris: 50mL levures + 5mL glucose + 45mL H2O, 37°C

Tube H bleu foncé: 5mL levures + 50mL glucose + 45mL H2O, 37°C

Hypothèses Expérience 1

1. La fermentation est effectuée par les levures. Sans levure, pas de fermentation possible, donc pas gonflement du ballon
2. Si on tue les levures, pas de fermentation.
3. La température influe sur la production de CO2: à froid, moins de production de CO2, optimum à 37°C
4. La fermentation est dépendante de la quantité de glucose à disposition: sans glucose, pas de fermentation.
5. ???

Résultats Expérience 1

Collecte des résultats: mesure du diamètre (cm) des ballons toutes les 5 minutes

Temps [min] : (toutes les minutes)

t0: 0 [min]

• Tube A : 0
• Tube B : 0
• Tube C : 0
• Tube D : 0
• Tube E : 0
• Tube F : 0
• Tube G : 0
• Tube H : 0

t1: 5 [min]

• Tube A : 0
• Tube B : 0
• Tube C : 0
• Tube D : 0
• Tube E : 0
• Tube F : 0
• Tube G : 0
• Tube H : 0

t2: 10 [min]

• Tube A : 0
• Tube B : 0
• Tube C : 0
• Tube D : 0
• Tube E : 0
• Tube F : 0
• Tube G : 0
• Tube H : 0

t3: 15 [min]

• Tube A : 0.4
• Tube B : 0
• Tube C : 0
• Tube D : 0
• Tube E : 0
• Tube F : 0
• Tube G : 0
• Tube H : 0

t4: 20 [min]

• Tube A : 2.5
• Tube B : 0(s'est dressé)
• Tube C : 0
• Tube D : 0.5
• Tube E : 0.5
• Tube F : 0
• Tube G : 0 (on commence à sentir quelque chose)
• Tube H : 0

t5: 25 [min]

• Tube A : 3.5
• Tube B : 0
• Tube C : 0
• Tube D : 0.5
• Tube E : 2.8
• Tube F : 0
• Tube G : 0.5
• Tube H : 0

t6: 30 [min]

• Tube A : 4.5
• Tube B : 0.1
• Tube C : 0
• Tube D : 0.5
• Tube E : 3.5
• Tube F : 0
• Tube G : 0.7
• Tube H : 0

t7: 35 [min]

• Tube A : 5.6
• Tube B : 0
• Tube C : 0
• Tube D : 0.6
• Tube E : 4.2
• Tube F : 0
• Tube G : 3
• Tube H : 0.1

t8: 40 [min]

• Tube A : 5.8
• Tube B : 0
• Tube C : 0
• Tube D : 1.1
• Tube E : 4.7
• Tube F : 0
• Tube G : 3.2
• Tube H : 0.2

t8: 45 [min]

• Tube A : 6.2
• Tube B : 0
• Tube C : 0
• Tube D : 0.9
• Tube E : 5.6
• Tube F : 0
• Tube G : 3.5
• Tube H : 0.3

Graphique Expérience 1

Expérience 2

Dans cette expérience nous chercherons à mettre en évidence le type de gaz dégagé par le métabolisme de la levure.
Nous disposons du montage suivant: un Erlenmeyer boucher relié par un tube à une éprouvette contenant de l'eau de chaux (Ba(OH)₂. L'eau de chaux se trouble en présence de CO₂.

L'Erlenmeyer est rempli d'une solution de levures (50 ml) et d'une solution de glucose (50 ml). Un fine couche de paraffine est déposée sur la solution pour l'isoler de l'air contenu dans le flacon.

Conditions expérimentales

Tube I: 50mL Levures + 50mL sucre; 37°C

Tube J: 50mL Levures + 50mL eau (sans sucre; contrôle négatif); 37°C

Hypothèses Expérience 2

1. Si la fermentation a lieu, le gaz produit est du CO2: l'eau de chaux se trouble

Observations

Les résultats de l'expérience 1 sont montrés dans le graphique suivant.
Pour l'expérience 2, l'eau de chaux se trouble dans le tube I mais pas le J, qui est le contrôle négatif.

Discussion et conclusion

Étapes permettant de déterminer les éléments d'une discussion

Dans une première expérience, nous avons décidé d'étudier ce qui permettait véritablement la fermentation. Pour cela, nous avons utilisé plusieurs tubes et avons changé à chaque un seul paramètre.

Durant cette expérience 1, nous avons utilisé un tube pour le contrôle positif et deux tubes pour le contrôle négatif. Dans le premier tube A (contrôle positif), les conditions sont idéales(50mL levures + 50mL glucose, 37°C) pour que la fermentation ait lieu. En revanche, dans les deux autres tubes B et C (contrôles négatifs), nous avons changé un paramètre par tube : dans le tube B, il n'y pas de glucose et dans le tube C, il n'y pas de levure. Par conséquent, le processus de fermentation n'est pas possible. En effet, dans le tube B, il manque le microorganisme générant la fermentation, c'est-à-dire le glucose. Dans le tube C, il manque le produit de départ qui est la levure. Nous voyons ceci dans les résultats obtenus pour ces deux tubes: en effet le diamètre du ballon n'a pas changé durant toute l'expérience.

Pour les deux tubes suivants (D et E), nous avons modifié la température. Les tubes D et E contenaient 50mL levures et 50mL glucose. Le tube E a été préincubé à 70°C pendant 15' et remis à 37°C, tandis que le second a été mis à 0°C puis 37°C. Ce que nous pouvons observer par rapport aux résultats est que le tube D change très peu de volume. Ceci est expliqué par la haute température durant la préincubation. En effet, la plupart des cellules de levure sont mortes (température léthale). Mais le temps de la préincubation a certainement été insuffisant pour tuer absolument toutes les cellules: c'est pourquoi nous avons tout même observer un léger gonflement du ballon indiquant que le processus de fermentation a eu lieu mais dans une moindre mesure.
Dans le tube E, la fermentation a également eu lieu et ce malgré la préincubation à 0°C. Elles ont pris plus de temps pour fermenter car la préincubation à froid les a plongé dans un état de léthargie. Cependant, nous pouvons conclure que les cellules n'ont pas été tuées.
Pour le tube F, nous l'avons laissé à 0°C durant toute l'expérience, ce qui nous a permis de démontrer que la fermentation a été impossible, car les cellules étaient complètement inactives.

Pour les tubes G et H, nous avons décidé de modifié la concentration de sucre ou de levures.

• Tube G : 50mL levures + 5mL glucose + 45mL H2O, 37°C
• Tube H : 5mL levures + 50mL glucose + 45mL H2O, 37°C

Si l'on compare le contrôle positif (tube A) aux deux tubes G et H, on remarque que les quantités de glucose et de levure sont déterminantes. En revanche, la comparaison entre les deux tubes montre que le paramètre "nombre de levure" est le plus conséquent. En effet, nous avons pu observer un meilleur gonflement du ballon lorsque les levures étaient non diluées alors que la dilution du glucose permettait néanmoins le gonflement du ballon, bien que dans une moindre mesure.

À la suite de ce travail, nous avons pu constater que les résultats sont concluants. Cependant, il y a plusieurs critiques à faire. Premièrement, nous ne sommes pas sûrs de l'absence totale d'oxygène. Nous ne pouvons donc pas déterminer avec certitude que les levures ont effectué une fermentation et non pas une respiration cellulaire.On pourrait utiliser une pompe a vide afin d'enlever completement l'oxygène.
De plus, les mesures faites par l'écarteur n'étaient pas précises d'autant que l'élève ayant manipulé l'outil le faisait pour la première fois de son existence. De plus, l'instrument utilisé n'était pas adapté à mesurer des ballons de cette dimension.

La deuxième expérience avait pour but de mettre en évidence le type de gaz dégagé par le métabolisme de la levure. Pour cela nous avons disposé d'un montage particulier: un Erlenmeyer rempli d'une solution de levures (50 ml)et d'une solution de glucose (50 ml)bouché et relié par un tube à une éprouvette contenant de l'eau de chaux (Ba(OH)2.

Lors de cette seconde expérience, nous avons pu constaté que l'eau de chaux contenue dans le montage contenant du glucose a été troublée alors que dans le montage en absence de glucose, il ne s'est rien passé. Ceci s'explique car le CO2 a réagi avec l'eau de chaux qui a formé un précipité. Donc durant la fermentation, il y a production de CO2 et le montage utilisé permet à ce gaz d'entrer en contact avec l'eau de chaux.

Les critiques que nous pouvons cependant formuler pour cette expérience sont les suivantes. Tout d'abord, nous avons remarqué que l'erlenmeyer n'était peut-être pas fermé d'une manière totalement hermétique laissant alors l'oxygène rentrer.On pourrait utiliser un appareil adequat pour faire le vide.
Une autre critique serait que l'on aurait dû mettre la solution de paraffine sur la solution glucose-levure et non sur l'eau de chaux (comme nous l'a indiqué notre maître!!!).

Conclusion La fermentation est donc une réaction biochimique qui nécessite du glucose et du milieu anaérobie pour pouvoir convertir l'énergie qui se trouve dans une source de carbone.Cette réaction d'oxydo-réduction permet de produire de l'éthanol et recycler du NAD+ Cette experience nous a permis de mieux comprendre la fermentation et les differents facteurs qui y interviennent.

Références

Biologie 7e édition - N. Campbell, J. Reece - Pearson Education
Biologie - Raven, Johnson, Losos & Singer - de boeck
http://www.cegep-ste-foy.qc.ca/profs/gbourbonnais/
http://fr.wikipedia.org/wiki/Wikip%C3%A9dia:Accueil_principal
http://www.planetegene.com/view/la-fermentation-alcoolique
http://pedagogie.ac-amiens.fr/svt/info/logiciels/animmetabo/ferment.htm