Fermentation 2BIOS01 2010

La méthode scientifique

Le mot "science" vient du latin scientia qui signifie "connaissance". Les sciences de la nature s'intéressent aux connaissances sur la réalité physique du monde dans lequel nous vivons. L'activité scientifique présuppose, d'une part, l'existence d'une réalité accessible et, d'autre part, la capacité de la comprendre, du moins en partie.

S'il n'y a pas de méthode pour construire la science, il en existe une pour la juger, une fois qu'elle a été construite, c'est-à-dire une méthode permettant de déterminer si une représentation scientifique est conforme à la réalité.

Selon Roland Omnès il existe une méthode bien définie qui fait ressortir la spécificité de la science : la méthode à quatre temps.

On peut représenter ces quatre temps de façon cyclique.

• L'exploration consiste à observer des phénomènes avant que l'on ait avancé une hypothèse qu'il va falloir vérifier.
  
• La conceptualisation conduit à l'élaboration de modèles qui pourraient régir la représentation du réel.
  
• L'élaboration échafaude les conséquences logiques qui découlent des hypothèses envisagées.
  
• Le test de l'expérimentation : on doit pouvoir tester les prévisions qu'on peut faire à partir du modèle. Pour être valable une théorie doit pouvoir être réfutée.

Introduction

Les levures

Les levures sont des champignons (mycètes) unicellulaires. Elles peuvent obtenir l'énergie nécessaire à leur survie par respiration ou par fermentation. Au cours de ce laboratoire, nous utiliserons la levure de bière Saccharomyces cerevisiae. Celle-ci est couramment utilisée en industrie alimentaire pour produire des boissons fermentées (vin, bière) ou pour faire lever la pâte (pain). En présence d'oxygène, Saccharomyces cerevisiae fait surtout de la respiration. Par contre, si l'oxygène vient à manquer, elle passe à la fermentation alcoolique. La fermentation ne nécessite pas d'oxygène, mais elle libère environ 15 fois moins d'énergie que la respiration.

La fermentation

La fermentation et la respiration cellulaire aérobie comportent toutes les deux la processus de la glycolyse. Le produit finale de celle-ci, soit le pyruvate, représente un carrefour qui mène à deux voies cataboliques :

• en présence d'oxygène (aérobiose), le pyruvate se fait convertir en acétyl-CoA, et l'oxydation prend la voie du cycle de l'acide citrique (cycle de Krebs).
• en absence d'oxygène (anaérobiose), il se soustrait au cycle de l'acide citrique et prend alors la voie de la fermentation. (cf. annexe 1)

La fermentation alcoolique

Au cours de la fermentation alcoolique, le glucose est converti en gaz carbonique et en éthanol (alcool éthylique). (cf. annexe 2a)

C₆H₁₂O₆ -----> 2CO₂ + 2CH₃-CH₂-OH + ENERGIE

D'autres monosaccharides que le glucose peuvent aussi être utilisés. Certains monosaccharides peuvent directement entrer dans la chaîne de réactions de la fermentation (c'est le cas du fructose). D'autres peuvent être transformés en glucose par des enzymes de la cellule. Dans le cas des disaccharides, ceux-ci doivent d'abord être digérés en monosaccharides. Cette digestion peut se faire à l'extérieur de la cellule ou à l'intérieur de celle-ci. Dans les deux cas, la digestion se fait sous l'action d'enzymes spécifiques synthétisées par la levure.

La fermentation lactique

Lorsque l'apport en oxygène est insuffisant, la plupart des cellules animale régénère le NAD⁺ par un processus de fermentation sans décarboxylation. Les cellules musculaire par exemple utilisent une lactate déshydrogénase, enzyme qui transfère l'hydrogène du NADH sur le pyruvate produit par glycolyse. Cette réaction transforme le pyruvate en lactate et le NADH en NAD⁺, ce qui boucle le cycle métabolique et permet à la glycolyse de se poursuivre tant que du glucose est disponible. Le lactate produit est évacué du muscle par le système sanguin, mais cette élimination n'est pas suffisamment rapide, l'accumulation d'acide lactique interfère avec le fonctionnement du muscle et contribue à la fatigue musculaire.(cf. annexe 2b)

C₆H₁₂O₆ -----> CH₃-CHOH-COOH + ENERGIE

Matériel

Voici le matériel utilisé au cours de nos expériences:

• levure boulangère diluée
• solution de glucose 20%
• béchers, Erlenmeyers, cylindres gradués
• BaOH)₂: hydroxyde de baryum
• pipettes plastiques
• paraffine
• ballons
• bains marie à 37° et 60°C
• agitateur magnétique
• thermomètre
• bac avec des glaçons
• système pour Expérience Eau de Chaux
• pipettes graduées de 2 ml
• gommette
• eau distillée
• microscope
• appareil photo numérique

Méthodes

Expérience 1

Dans cette expérience nous étudierons l'impact de la température sur l'activité métabolique des levures. Nous ne ferons varier que ce facteur. Le choix des températures doit être pertinent pour provoquer de variations métaboliques observables.

Nous disposons de deux bain-maries à 37°C et 60°C et d'un bac rempli de glace. Les tubes A et B (contrôles négatifs), contenant respectivement 25 ml de levures et 25 ml de glucose, sont mis dans toutes les conditions expérimentales (0°-TA-37°-60°C).
Les éprouvettes sont bouchées chacune avec un ballon.

Les "tubes" C, D. E, F sont remplis selon les indications ci-dessous. Utilisez des Erlenmeyers que vous boucherez avec un ballon.

A l'aide du chronomètre, relevez l'état de gonflement des différents ballons toutes les 5 minutes.

Conditions expérimentales

Tube A (contrôle négatif) : Levures 50 ml

Tube B (contrôle négatif) : Glucose 50 ml

Tube C : Glucose 50 ml / levures 50 ml - 0°C

Tube D : Glucose 50 ml / levures 50 ml - TA°C

Tube E : Glucose 50 ml / levures 50 ml - 37°C

Tube F : Glucose 50 ml / levures 50 ml - 60°C

Expérience 2

Dans cette expérience nous chercherons à mettre en évidence le type de gaz dégagé par le métabolisme de la levure.

Nous disposons du montage suivant : un Erlenmeyer boucher relié par un tube à une éprouvette contenant de l'eau de chaux (Ba(OH)₂. L'eau de chaux se trouble en présence de CO₂.

Un Erlenmeyer est rempli d'une solution de levures (50 ml) et d'une solution de glucose (50 ml). Un fine couche de paraffine est déposée sur la solution pour l'isoler de l'air contenu dans le flacon.

Un autre Erlenmeyer est rempli de 50 ml de levure uniquement, avec le même montage.

Hypothèses

1. Plus la température est élevée plus le métabolisme est élevé (actif).
2. Le glucose n'est pas indispensable à la fermentation.
3. Le glucose stimule la fermentation
4. Pas de métabolisme à 0°
5. Une température trop élevée (à déterminer) tue les levures.
6. Le glucose seul ne produit pas de CO₂.
7. La levure fermente en absence d'oxygène (anaérobie) et dégage du CO₂. L'eau de chaux se trouble.

Observations et résultats

Expérience 1

Temps [min] : (toutes les 5 minutes)

t0 : 0 [min]

• tous les ballons sont dégonflés.

t1 : 5 [min]

• Tube A : RAS (rien à signaler)
• Tube B : RAS
• Tube C : RAS
• Tube D : RAS
• Tube E : RAS
• Tube F : léger gonflement.

t2 : 10 [min]

• Tube A : Léger gonflement (le ballon reste flasque).
• Tube B : RAS
• Tube C : RAS
• Tube D : Léger gonflement.
• Tube E : Léger gonflement.
• Tube F : Le gonflement a progressé.

t3 : 15 [min]

• Tube A : Léger gonflement (pas de changements).
• Tube B : RAS
• Tube C : RAS
• Tube D : Léger gonflement (pas de changements).
• Tube E : Gonflement bien visible (le ballon est dressé).
• Tube F : Gonflement bien visible (le ballon est dressé).

t4 : 20 [min]

• Tube A : Léger gonflement (pas de changements).
• Tube B : RAS
• Tube C : RAS
• Tube D : Léger gonflement (pas de changements).
• Tube E : Gonflement progresse (augmentation du volume)
• Tube F : Pas de changements visibles.

t5 : 25 [min]

• Tube A : Léger gonflement (pas de changements).
• Tube B : RAS
• Tube C : RAS
• Tube D : Léger gonflement (pas de changements).
• Tube E : Ballon très gonflé.
• Tube F : Pas de changements visibles.

t6 : 30 [min]

• Tube A : Léger gonflement (pas de changements).
• Tube B : RAS
• Tube C : RAS
• Tube D : Léger gonflement (pas de changements).
• Tube E : Ballon très gonflé.
• Tube F : Pas de changements visibles.

t7 : 35 [min]

• Tube A : Léger gonflement (pas de changements).
• Tube B : RAS
• Tube C : RAS
• Tube D : Léger gonflement (pas de changements).
• Tube E : Ballon très gonflé.
• Tube F : Pas de changements visibles.

t8 : 40 [min] - État final

• Tube A : Léger gonflement.
• Tube B : Dégonflé (état initial)
• Tube C : Dégonflé (état initial)
• Tube D : Léger gonflement.
• Tube E : Ballon très gonflé.
• Tube F : Ballon gonflé, pas de changements depuis t4

Expérience 2

Le flacon est déposé dans le bain-marie à 37°C.
Le milieu et les levures sont isolés par le film de paraffine.
Les levures ont donc un métabolisme anaérobie : la FERMENTATION.
Après environ 30 minutes, l'eau de chaux n'est toujours pas trouble.
Après 45 min puis 60 min, l'eau de chaux a bien réagit avec le CO₂ produit par la fermentation.
De petites bulles sont visibles à travers la paraffine, ce qui prouve le dégagement de CO₂.

Discussion et conclusion

Étapes permettant de déterminer les éléments d'une discussion

Les résultats obtenus nous permettent de discuter des hypothèses préliminaires.

Expérience 1

Discussion

A la vue des résultats, nous pouvons affirmer que la température joue un rôle prépondérant et limitant dans l'activité métaboliques des levures. Le gonflement des ballons est produit par le dégagement de gaz (CO₂) par les levures donc par l'activité métabolique. Le niveau de gonflement nous informe sur l'intensité du métabolisme (mesure quantitative), mais pas sur la qualité du gaz (nous supposons que c'est du CO₂).

• Les levures sans glucose n'ont quasiment pas d'activité métabolique, cette molécule est donc nécessaire à leur métabolisme.
• Le glucose seul ne provoque pas de dégagement de gaz cette molécule est inerte.
• A 0°C, l'activité est nulle, cette température ne permettant pas un métabolisme actif.
• A TA (~20°C), l'activité est très faible, cette température n'est pas suffisante pour que le métabolisme se fasse de manière optimale.
• A 37°C, l'activité est maximale, les conditions de température permettent une activité métabolique optimale avec une forte production de gaz.
• A 60°C, l'activité est initiée mais s'interrompt après 20 minutes. Le milieu est monté en température progressivement, passant par la température optimale de fonctionnement (premiers dégagements de gaz) puis la température a inactivé les levures et le métabolisme s'est arrêté.
  

Quelques expériences supplémentaires auraient permis de mieux cerner les conditions de l'activité métabolique et le facteur limitant qu'est la température :

• Mettre les bactéries à 0°C avant le début de l'expérience puis les mettre à 37°C ; nous aurions ainsi pu déterminer si a température de 0°C est létale pour les levures ou si elle inactive simplement le métabolisme.
• Mettre les bactéries à 60°C avant le début de l'expérience puis les mettre à 37°C ; nous aurions ainsi pu déterminer si a température de 60°C est létale pour les levures ou si elle inactive simplement le métabolisme.
• Tester le contenu en éthanol de notre solution pour déterminer si le processus de fermentation a bien été effectué ; un capteur de vapeur d'alcool (éthylomètre) nous donnerais cette information.

Conclusion

La vitesse des réactions chimiques surtout les réactions enzymatiques, dépendent beaucoup de la température. Par conséquent, le métabolisme tissulaire, et finalement la vie d'un organisme, dépendent du maintien de l'environnement interne à des températures compatibles avec les réactions métaboliques facilitées par des enzymes. Il existe donc pour chaque organisme une température minimale critique en dessous de laquelle le métabolisme ralentit jusqu'à provoquer l'arrêt définitif de toute activité enzymatique ce qui provoquera la mort de la plupart des organismes.
Il existe aussi une température critique maximale au delà de laquelle les protéines, donc les enzymes vont perdre leur activité (par dénaturation) et provoquer des dysfonctionnements métaboliques graves menant à la mort de la plupart des organismes.

Il existe cependant un grand nombre d'organismes qui vivent dans des conditions extrêmes :
Les invertébrés (larves ou imago) ainsi que certains batraciens se laissent geler pendant l'hiver et renaissent au printemps.
Certaines bactéries thermophiles peuvent vivre et se multiplier entre 80-100°C.

Expérience 2

Discussion

Avec le montage proposé, les bactéries sont en présence de glucose et cette solution est isolée de l'air (dont O₂) par une fine couche de paraffine.

Ces organismes effectuent donc une dégradation du glucose en pyruvate via la GLYCOLYSE (2ATP produits) puis la FERMENTATION produit du CO₂, du NAD⁺ et de l'éthanol.

Le dégagement d'un gaz est visible à travers la paraffine et la réaction avec l'eau de chaux nous prouve que nous avons à faire à du CO₂.

Conclusion

La fermentation nécessite du glucose et un milieu anaérobie ; elle produit du gaz carbonique, de l'éthanol et permet de recycler le NAD⁺.

Références

Biologie 7e édition - N. Campbell, J. Reece - Pearson Education
Biologie - Raven, Johnson, Losos & Singer - De Boeck Université
Physiologie animale - R. Eckert - De Boeck Université
http://www.cegep-ste-foy.qc.ca/profs/gbourbonnais/
http://fr.wikipedia.org/wiki/Wikip%C3%A9dia:Accueil_principal
http://www.planetegene.com/view/la-fermentation-alcoolique
http://pedagogie.ac-amiens.fr/svt/info/logiciels/animmetabo/ferment.htm