Fermentation 2BIOS02

Introduction

La fermentation est une réaction biochimique de conversion de l'énergie chimique contenue dans une source de carbone (glucose souvent) en une autre forme d'énergie directement utilisable par la cellule en l'absence de dioxygène (milieu anaérobie). Le terme «fermentation» dérive du latin fervere qui signifie bouillir: un liquide en cours de fermentation, alcoolique par exemple, présente un important dégagement gazeux et montre l’aspect d’un liquide en ébullition.
Nous allons observer la fermentation alcoolique de levures dans différents milieux. Pour que celle-ci ait lieu, il faut mettre des cellules (ici des levures) dans un milieu dépourvu d'oxygène (=anaérobie) à une température idéale de 35°C à 40°C.(Voir Annexes 1 et 2)
La levure utilisée dans notre expérience est un champignon unicellulaire apte à provoquer la fermentation des matières organiques animales ou végétales appelée 'Saccharomyces cerevisae' ou levure boulangère. Les levures sont employées pour la fabrication du vin, de la bière, des spiritueux, des alcools industriels, du pain et d'antibiotiques.
La glycolyse est la dégradation d'une mole de glucose en deux moles de pyruvates: c'est une voie catabolique qui existe dans toutes les cellules (Voir Annexe 3).
Elle représente le premier stade de la respiration cellulaire en aérobie, c'est-à-dire dans un milieu oxygéné ou le processus cellulaire s'effectue en présence de dioxygène. La glycolyse est également le premier stade de la fermentation en anaérobie, c'est-à-dire dans un milieu privé d'oxygène.
La glycolyse a lieu dans le cytoplasme. Une molécule de glucose est transformée en deux molécules de pyruvate grâce à l'oxydant biologique NAD+ qui subit une réduction en NADH. L'énergie réactionnelle libérée par la glycolyse est stockée sous forme chimique grâce à cette énergie, 2 molécules d'ADP réagissent avec deux molécules d'acide phosphorique pour donner deux molécules d'ATP, riches en énergie.
Dans un premier temps, les levures libèrent des enzymes qui permettent la transformation des sucres en glucose, la base de la fermentation. Le glucose est alors transformé en acide pyruvique (=pyruvate), par la glycolyse. La glycolyse se divise en deux étapes,la phase d'investissement d'énergie et la phase de libération d'énergie. La première consiste à utilisé 2ATP pour produire 2ADP + 2P, cette investissement va lui servir dans la deuxième phase, lorsqu’il va utiliser 4ADP +4P pour formé 4ATP et une oxydoréduction durant laquelle le glucose réduit NAD+en NADH +H+ et le glucose s’oxyde en 2 Pyruvate 2H2O.
La fermentation en absence de dioxygène (O2) peut prendre deux vois différentes: la fermentation lactique et la fermentation alcoolique (Voir Annexes 1 et 2). Dans le cas présent, nous sommes en présence d'une fermentation alcoolique qui se définit par la conversion du pyruvate en éthanol avec libération de CO2. Ce processus métabolique s'effectue en deux étapes: tout d'abord, du CO2 qui est prélevé au pyruvate ensuite la transformation de l'Acétaldéhyde en éthanol. Le but de notre expérience est de montrer quels sont les différents facteurs influençant le déroulement de la fermentation. De plus, nous aussi dû construire un protocole d'expérience en groupe et effectuer ensuite les expériences pour vérifier les hypothèses de départ. La fermentation a été décelée soit par le dégagement de CO2 dans des ballons, soit par le changement de coloration de l'eau de chaux. Finalement, nous nous sommes aussi intéressés à la morphologie des cellules de levures que nous avons observé au microscope optique.

Références

• Campbell chapitre chapitre 9 et Raven chapitre 9
• http://www.planetegene.com/view/la-fermentation-alcoolique[1]
• http://pedagogie.ac-amiens.fr/svt/info/logiciels/animmetabo/ferment.htm[2]

Matériel

Voici le matériel utilisé au cours de nos expériences:

• levure boulangère diluée
• solution de glucose 20%
• béchers, Erlenmeyers, cylindres gradués
• Ba(OH)2: hydroxyde de baryum
• pipettes plastiques
• paraffine
• ballons
• bains marie à 37° et 60°C
• agitateur magnétique
• thermomètre
• bac avec des glaçons
• système pour Expérience Eau de Chaux
• microscope
• appareil photo numérique de Dominique
  

(voir Annexe 4)

Méthodes

Nous avons fais deux expériences différentes afin de voir et comprendre la fermentation:

• Dans la première expérience nous avons créer 7 conditions expérimentales, en mélangeant de la levure diluée avec du glucose ou de l'eau dans des béchers gradués. Nous avons ensuite bouché les différents erlenmeyers avec des ballons. Ceci ayant pour but d'observer si les ballons gonflent ou pas, pour montrer si une fermentation se produit, grâce au dégagement de gaz carbonique qui ferait gonfler le ballon. Puis nous avons placé les différentes conditions expérimentales obtenues qui contenaient du glucose (C6H12O6)et de la levure, à différentes températures. A savoir 37°C, 60°C, 0°C,et enfin à la température ambiante de la classe (~20°C) (voir Annexes 5, 6). Ceci nous a permis d'observer si la température jouait un certain rôle dans le processus de fermentation.
• Pour la deuxième expérience, nous voulions également observer la fermentation, mettant d'autre facteur en jeu. Nous avons pour cela utilisé un système isolant l'eau de chaux grâce à de la paraffine connectant deux tubes connecté par un tuyau. Nous avons cependant varié le contenu du tube qui ne contenait pas l'eau de chaux: pour un des tubes nous avons mis une fois de la levure mélangé avec du glucose et une autre fois de la levure mélangée avec de l'eau. Puis nous avons laissé réagir les deux systèmes à la température de la pièce afin de voir comment les substances vont réagir.
  (voir Annexes 7)

Expérience 1

Conditions testées

• A: 50mL levures; 50mL glucose; 37°C
  
• B: 50mL levures; 50mL eau; 37°C
  
• C: 50mL levures; 50mL glucose; 0°C
  
• C': 50mL levures; 50mL glucose; 0°C (pendant 33 minutes) puis déposé à 37°C
  
• D: 50mL levures; 50mL glucose; 20°C
  
• E: 50mL levures; 50mL glucose; 60°C pendant 10' puis 20°C
  

Résultats

Read-out: gonflement du ballon
Voici les résultats obtenus; certains ballons ont gonflés et d'autres pas.

• A: Le ballon est relevé et très gonflé.
  
• B: Le ballon n'est pas du tout relevé, cependant il est un peu gonflé.
  
• C: Le ballon n'est pas du tout relevé ni gonflé.
  
• C': Après que nous avons mis cet erlenmeyer à 37°C le ballon a un peu gonfler.
  
• D: Le ballon est relevé et gonflé.
  
• E: Le ballon n'est pas du tout gonflé, mais nous avons pu remarqué que lorsque nous avons placé cet erlenmeyer à la température de la pièce le ballon a commencé à gonfler plus rapidement que le C'
  

( Voir Annexe 8)

Expérience 2

L'expérience 2 est l'expérience dans laquelle nous avons utilisé de l'eau de chaux. L'eau de chaux (2mL) est isolée au milieu par de la paraffine. Nous avions deux tubes avec deux mélanges différents:

• F: 50mL levures; 50mL glucose; 20°C
  
• G: 50mL levures; 50mL eau; 20°C
  

Résultats

Nous avons obtenue après 10 minutes d'attente deux résultats différent avec nos deux tubes: Read-out: coloration de l'eau de chaux et bulles (dégagement de CO2).

• F: Après 10min nous avons dans le tube où se trouve de l'eau de chaud une apparition de bulles qui se trouve être un dégagement de CO2 . De plus celle-ci devient trouble; il y a donc formation d'un précipité
  
• G: Avec se tube nous n'avons eux aucun changement de couleur ni de réaction entre cette substance avec l'eau de chaud.
  

(Voir Annexe 7)

Expérience 3

Pour notre troisième expérience, nous avons fait un dessin d'observation, en trois parties (sur le dessin de haut en bas):

• cellules de levure de concentration X dans de l'eau, à température ambiante.

On pouvait voir de petits noyaux, et les levures avaient une certaines mobilité.

• cellules de levure avec ajout de glucose, à température ambiante.

Avec cet ajout de glucose, les noyaux de levure ont augmenté de volume, et semblent beaucoup plus proches, formant des groupements plus compact que pour le premier dessin d'observation.

• cellules de levure avec ajout de glucose, amené à une température de 60°C.

La chaleur devrait avoir détruit les cellules, en tout cas il est très visible que leur noyau à doubler de taille, touchent même les membranes plasmiques des levures. Très peu ont garder leur mobilité.
(Voir Annexe 9)

Discussion des résultats

Expérience 1

Lors de notre première expérience, nous avons pu constater que nos résultats différaient selon la variable que nous avons modifié.
En effet, dans le premier tube A contenant de la levure et du glucose, à 37°C, le ballon a gonflé. Ce qui laisse présager une présence de CO2 dans le ballon. Cela nous montre que la fermentation a bien eu lieu puisque la fermentation alcoolique se définit par:
C6H12O6(glucose)+ 2ATP + 2P → 2CO2 + 2CH3CH2OH (éthanol)+ 2 ATP .
Nous voyons donc comment la fermentation fonctionne puisqu'elle à réunit tous les facteurs à son bon déroulement à savoir: source de carbone(glucose), une température idéale de fermentation entre 35 °C 40 °C, présence d'organismes vivants effectuant la fermentation, etc.
Dans le tube B, il n'y a pas eu de fermentation puisque nous avons retiré le glucose et ainsi celle-ci n'a pas pu se faire, étant donné qu'il lui manquait un des produits de départ; c'est pourquoi le ballon n'a pas gonflé.
Dans le tube C nous n'avons pas détecter de fermentation, et donc le ballon n'a pas gonflé. En effet, la levure est un champignon unicellulaire apte à provoquer la fermentation des matières organiques animales ou végétales. Cependant la température optimale de culture des levures se situe en général entre 25 et 30°C, ainsi lorsque la température est inférieure (ici proche de 0°C), la levure n'est plus apte à provoquer la fermentation.
Dans le cas du tube C', nous voyons que la fermentation a eu lieu, par le gonflement du ballon. En effet, les conditions nécessaires à la fermentation étaient à nouveau réunies: température, glucose. L'exposition du tube C à 0° n'a pas tué mais endormi les levures, ce qui fait que quand nous avons replacé ce tube à une température d'environ 37°C, la levure a repris son activité métabolique de fermentation car la température était propice.
Le ballon du tube D, qui était à température ambiante, a également gonflé. Nous voyons ainsi que la fermentation avait les conditions nécessaires pour bien se dérouler.
Le ballon du tube E n'a, quant à lui, pas gonflé. En effet, le tube était à 60°C et les levures ne sont pas thermorésistantes donc nous avons tué la plupart des levures à cause de la température trop élevée du milieu. Nous avons pu cependant observer au microscopes qu'après être sorties environ 10 minutes de l'eau a 60°, les levures n'étaient pas tuées car elles se sont remises à bouger. On peut donc constater que nous ne les avons pas laissé assez longtemps dans un milieu a 60°C. Pourtant, la destruction cellulaire commence dès 52°C, c'est pourquoi elles n'étaient plus aptes, pour certaines d'entres elle, à fermenter.
( Voir Annexe 8)

Expérience 2

La deuxième expérience consistait à déceler le dégagement de CO2 dû à la fermentation grâce à la coloration d'eau de chaux qui se trouble en contact avec ce gaz. Nous avons testé deux conditions différentes:

• tube F: levures + glucose
• tube G: levures sans glucose (remplacé par de l'eau distillée)

Ces deux tubes ont été placé à température de la salle (~20°) et la fermentation a été détectée par coloration de l'eau de chaux et la présence d'un précipité. L'eau de chaux se trouble en présence de dioxyde de carbone (CO2). Le précipité blanc formé est du carbonate de calcium (CaCO3).
Le résultat du tube F est que l'eau se trouble et un précipité s'est formé. Nous pouvons en conclure que la fermentation a eu lieu et qu'il y a eu dégagement de CO2.
La réaction est la suivante: Ca(OH)2 + CO2 → CaCO3 + H2O
Par contre pour le tube G nous avions de la levure avec de l'eau mais sans glucose. Donc nous avions un des produits de départ manquant. Nous pouvions donc prévoir qu'il n'y aurait pas de fermentation. Ceci a été démontré par l'absence de réaction métabolique (pas de précipité et l'eau de chaux ne s'est pas troublée).
( Voir Annexe 7)

Conclusion

Cette expérience nous a permis d'observer un dégagement de CO2 par le biais des ballons qui ont gonflé ou non. Nous avons pu observer que le dégagement de CO2 dépend de la température dans laquelle la fermentation se fait, et que pour faire de la fermentation les levures ont besoin de glucose (C6H12O6). Nous n'avons cependant pas fait de tube de contrôle, c'est a dire mettre un tube avec de l'eau et du glucose, ce qui est une erreur de notre part: ce contrôle nous aurait permis de valider nos résultats d'une meilleure manière.
Il aurait été intéressant d'essayer cette fermentation alcoolique avec un autre organisme que de la levure: on aurait très bien pu essayer avec d'autres agents aptes à faire de la fermentation alcoolique tels que différentes bactéries.
On pense que nous n'étions pas dans des conditions d'anaérobie, c'est-à-dire un milieu où il n'y a pas présence de dioxygène (O2). En effet nous étions dans une classe ce qui ne négligerait pas la présence d'O2, il se peut donc qu'il y ait eu de l'O2, mais notre fermentation a eu tout de même lieu. Bien que la fermentation soit un phénomène anaérobique, les levures ont besoin d'oxygène pour se multiplier donc on peut dire que l'oxygène présent a donc aider l'activité de la fermentation.
Finalement, nous aurions également pu tester la fermentation lactique en transformant du lait en yaourt ou en fromage frais par exemple.

Conclusion (bis)

Pour terminer... quelques petites photos du très bon moment que nous avons passé ensemble avec Eliane ce jour-là!
( Voir Annexes 10 et 11)